روشهای چندراهی با نتایج ساده شده و کاربرد آن در مطالعه برهمکنش نانوذرات طلا با dna

بخش اول: در آنالیز تاکر داده های سه راهی حاصل از سیستمهای شیمیایی یا زیستی، گاهی امکان پذیر است که با استفاده از اطلاعات قبلی که از سیستم در اختیار است، نوع ساده شده ای از روش تاکر به نام روش تاکر محدود شده را به کار بگیریم. در روش تاکر محدود شده، به غیر از عناصر محدودی از آرایه هسته مدل، مابقی عناصر مجبور به اتخاذ مقدار صفر می شوند. پارامتر ثبات هسته پارافک قبلا جهت تعیین تعداد اجزای صحیح مدل پارافک ارائه شده بود. در مطالعه حاضر این پارامتر به سایر مدلهای تاکر محدود شده و برای مقاصد متنوع تری گسترش داده شده است. این معیار جدید پارامتر ثبات هسته (tcc) تاکر نامگذاری شده است. وقتی سایز هسته و تعداد و چیدمان عناصر غیرصفر آن صحیح و منطبق بر واقعیات سیستم مورد مطالعه باشند، این پارامتر نزدیک به مقدار حداکثر یعنی %100 به دست خواهد آمد. در غیر اینصورت، tcc نزدیک به صفر به دست آمده و یا حتی در شرایط بدتر مقادیر منفی خواهد داشت. برای ارزیابی tcc از یک سری داده شبیه سازی شده فلورسانس مربوط به تیتراسیون کمپلکسومتری l (یک ترکیب رنگی) با b (یک عامل کمپلکس دهنده) استفاده شد. ترکیب رنگی به صورت یک اسید ضعیف با فرمهای پروتونه و ناپروتونه (hl, l) در محلولی با ph ثابت در نظر گرفته شد. به این ترتیب کمپلکس تشکیل شده هم می تواند دو فرم پروتونه و ناپروتونه به صورت lb و hlb داشته باشد. به این ترتیب یک هسته 2×4×4 برای شبیه سازی داده ها استفاده شد. برای آنالیز این داده ها از یک مدل تاکر محدود شده هسته صحیح و تعدادی مدل دیگر با هسته های نامناسب از لحاظ سایز و آرایش عناصر استفاده شد که tcc در تشخیص تمام این موارد موفق عمل نمود. همچنین از دو سری داده واقعی فلورسانس و آنالیز تزریق جریان پیوسته، که هر دو با کمبود رتبه مواجه بودند، برای ارزیابی میزان کارایی tcc در شرایط پیچیده تر مورد استفاده قرار گرفت که در این موارد هم عملکرد رضایتبخشی ارائه نمود. بخش دوم: ساختار منعطف dna تک رشته ای امکان جذب سطحی شدن آن را بر روی سطح با بار منفی نانوذرات طلا فراهم می سازد. این در حالیست که ساختار غیرمنعطف dna دو رشته ای و دافعه الکتروستاتیکی ساختار فسفاتی بیرونی آن با سطح نانوذرات طلا اجازه این کار را به dna دو رشته ای نمی دهد. در مطالعه حاضر از تفاوت رفتار dna تک رشته ای و دو رشته ای برای مطالعه هیبرید شدن و برهمکنش های دو الیگونوکلئوتید مکمل 21 نوکلئوتیدی با علائم اختصاری at و bt (که به ترتیب با فلوروفورهای فلورسئین و تگزاس رد نشان دار شده اند) در حضور نانوذرات طلای اصلاح نشده 13 نانومتری بهره گرفته شده است. الیگونوکلئوتیدهای مورد استفاده در این تحقیق متعلق به ژنوم ویروس hiv هستند. از روش اسپکترومتری فلورسانس برای این مطالعه استفاده شد. در ابتدا جهت فراهم آوردن اطلاعات اولیه در مورد سیستم و همین طور کنترل فرایند جذب سطحی dnaهای تک رشته ای روی نانوذرات طلا و فرونشانی فلوروفورهای متصل به آنها، دو سری تیتراسیون در حضور نانوذرات و دو سری در غیاب نانوذرات برای هر یک از dnaها انجام شد. به ازای هر مرحله از این تیتراسیونها یک طیف نشر فلورسانس ثبت شد که منجر به داده هایی دوراهی گشت. آنالیز حاصل از داده های دوراهی اطلاعاتی را راجع ظرفیت سطح نانوذرات طلا برای جذب نمودن dnaها فراهم ساخت. داده های سه راهی از تیتراسیون این دو dna تک رشته ای در حضور و درغیاب نانوذرات طلا و با دنبال کردن هیبرید شدن آنها با ثبت ماتریسهای تحریک- نشر فلورسانس حاصل شدند. برای آنالیز این داده ها که به واسطه حضور پدیده انتقال انرژی رزونانسی فلورسانس (fret) از فلورسئین به تگزاس رد در فرم هیبریدایز شده با کمبود رتبه مواجه بودند، از روشهای چندراهی پارافک و تاکر محدود شده استفاده گردید. مطالعه حاضر اولین مورد گزارش شده از آنالیز موفقیت آمیز داده های چندبعدی حاصل از سیستمهای نانو-زیستی توسط یک تکنیک کمومتریکسی چندراهی است. روش تاکر محدود شده در آنالیز داده ها و استخراج موثر اطلاعات شیمیایی از سیستم، بهتر از روش پارافک عمل نمود. نتایج حاصل نشان داد که برهمکنش سطح نانوذرات طلا برای جذب dna تک رشته ای وابسته به توالی آن می باشد. پروفایلهای مربوط به تغییرات سیگنال فلورسئین و تگزاس رد و همینطور پروفایلهای fret توسط تاکر از دادها استخراج شدند که این پروفایلها از لحاظ شیمیایی معنی دارتر و تفسیر پذیرتر از پروفایلهای متناظری بودند که با استفاده از روشهای کلاسیک تک متغیره از داده های خام به دست آمدند. بخش سوم: در این بخش از روشهای بر پایه مدل برای استخراج اطلاعات کیفی از داده های مربوط به برهمکنش های جذب سطحی دو dna تک رشته ای at و bt بر روی سطح نانوذرات طلای اصلاح نشده 13 نانومتری (داده های دوراهی ارائه شده در بخش قبل) و همینطور از این روشها برای به دست آوردن ثابت تعادل هیبرید شدن در حضور نانوذرات طلای 13 نانومتری از داده های سه راهی بخش قبل استفاده شد. برای آنالیز داده های دوراهی از روشهای اسکاچارد و لانگموییر و برای آنالیز داده های سه راهی هم از پروفایلهای غلظتی تخمین زده شده توسط الگوریتم نیوتون-رافسون به عنوان اطلاعات بر پایه مدل در روش تاکر محدود شده استفاده شده است. در روش اسکاچارد برهمکنش مولکول-محل اتصال از طریق دنبال کردن تغییرات نسبت مولکول های متصل شده به تعداد ثابتی از محل های اتصال با تغییرات غلظت تجزیه ای مولکول مورد مطالعه قرار می گیرد. در مطالعه حاضر، dna نقش مولکول متصل شونده را ایفا می کند و محل اتصال هم روی سطح نانوذره طلا واقع شده است. اطلاعات حاصل از نمودار خطی اسکاچارد عبارت بودند از ثابت های جذب سطحی و تعداد کل محل های اتصال (nmax) روی سطح هر نانوذره طلا. ثابت تعادل جذب سطحی برای at و bt یعنی kads,at و kads,bt، به ترتیب 107× (68/0±41/2) و 107× (59/0±82/2) به دست آمدند. مقادیر nmax برای at و bt هم به ترتیب 09/7±38/58 و07/4±65/46 محاسبه شدند. در روش لانگموییر معادله ای که kads و nmax جزء پارامترهای آن بودند، با تغییر این پارامترها، به نمودارهای حاصل از ترسیم کاهش سیگنال نشر فلورسانس at و bt توسط نانوذرات طلا بر حسب غلظت at یا bt آزاد برازش شدند. با این روش kads,at و kads,bt به ترتیب 107× (47/0±80/1) و 107× (46/0±38/2) محاسبه شده و مقادیر nmax برای at و bt هم به ترتیب 97/4±06/60 و13/3±05/46 ارزیابی شدند. در مدل سازی به روش نیوتن رافسون، از لگاریتم ثابت های جذب سطحی at و bt روی نانوذرات طلا (به صورت log(kads,at) و log(kads,bt)) که در بخش های قبل به دست آمده بودند استفاده شد. برای این منظور از میانگین مقادیر به دست آمده در دو بخش قبل یعنی از 32/7=log(kads,at) و 41/7= log(kads,bt)استفاده شد. اما لگاریتم ثابت تعادل هیبریدیزاسیون (log(katbt)) در این الگوریتم با روش جستجوی شبکه ای از 7 تا 10 با فواصل 1/0 تغییر داده شده و پروفایلهای شبیه سازی شده حاصل در هر مورد، به روش تاکر برای بازسازی داده ها معرفی شد تا بهترین مدل پیدا شود. پنج عنصر غیرصفر در هسته تاکر(g11، g12، g22، g32 و g34) هم از جمله پارامترهایی بودند که بهینه شدند. برای بهینه کردن عناصر هسته از الگوریتم بهینه سازی نیوتون- گوس-لونبرگ-مارکوار در درون جستجوی شبکه ای log(katbt) استفاده شد. حداقل مجموع مربعات باقیمانده نسبی در این روش به ازای پارامترهای بهینه برابر 575/0 به دست آمد. مقادیر بهینه پارامترها عبارت بودند از 0032/0±3025/9=log(katbt)، 1010×(0008/0±5377/1)=g11، 108×(0412/0±2680/8)=g21، 108×(0394/0±7283/2)=g22، 108×(0667/0±0789/4)=g24 و 1010×(0097/0±4522/2)=g34. بخش چهارم: جهت بررسی اثر سایز نانوذرات و همینطور دما در برهمکنش at و bt با نانوذرات طلا، در آزمایشهای تیتراسیون جداگانه هیبرید شدن bt با at در دماهای 15، 25، 35، 45 و 55 درجه سانتیگراد و در حضور نانوذرات 8، 13 و 20 نانومتری با روش اسپکتروسکوپی فلورسانس (با ثبت ماتریسهای تحریک-نشر در هر مرحله تیتراسییون) دنبال شد که حاصل 15 آرایه 7×101×97 بود. در روش اول آنالیز داده ها، آرایه های به دست آمده در امتداد مد غلظت سر هم زده شدند، به این ترتیب که اول پنج آرایه مربوط به تیتراسیون در دماهای مختلف (از کم به زیاد) در حضور نانوذرات 8 نانومتری، سپس پنج آرایه مربوط به نانوذرات 13 نانومتری و در آخر پنج آرایه مشابه حاصل از نانوذرات 20 نانومتری قرار گرفتند. نتیجه کلی ایجاد یک آرایه 105×101×97 بود. در روش دوم آنالیز داده ها، با کنار هم قرار دادن آرایه ها به صورت یک آرایه پنج راهی با ابعاد (سایز)3×(دما)5×(تیتراسیون)7×(تحریک)101×(نشر)97 تبدیل شدند. هر دوی آرایه های فوق با روش تاکر محدود شده مورد آنالیز قرار گرفتند. آنالیز تاکر سه راهی داده های سر هم زده شده دو پروفایل تحریک و نشر مجزا و یک پروفایل تلفیقی تیتراسیون-دما-سایز حاصل نمود. آنالیز تاکر پنج راهی به ازای هر یک از راه ها پروفایلهای مجزا ارائه نمود. نتایج حاصل نشان دادند که تغییر سایز نانوذرات، حداقل در دامنه مورد مطالعه، تغییر معنی داری را بر رفتار جذب سطحی at و bt روی سطح نانوذرات و در نتیجه بر هیبرید شدن آنها ایجاد نمی نماید. در مورد اثر دما در برهمکنشها، پروفایلهای حاصل از هر دوی روش های فوق با افزایش دما از 15 به 55 درجه درمورد همه سایزهای نانوذرات یک روند کلی کاهش در سیگنال bt، افزایش در سیگنال at و یک روند کلی افزایشی و سپس کاهشی در مورد atbt (fret) نشان می دهند که کاملا در ارتباط با فرایند ذوب شدن فرم هیبرید شده و تبدیل آن به دوdna تک رشته ای است. در مجموع، هر دوی مدلها در آنالیز داده ها موفق عمل نموده و نتایج حاصل آنها در توافق با یکدیگر بوده و از نظر شیمیایی از تفسیر پذیری مناسبی برخوردار بودند.